適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的透明顫菌血紅蛋白基因的人工構(gòu)建.doc
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適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的透明顫菌血紅蛋白基因的人工構(gòu)建,本文共20頁 10948字摘要淡紫擬青霉(paecilomyces lilacinus)是一種重要的植物線蟲寄生真菌，目前已在數(shù)個國家開發(fā)為生物殺線菌劑，廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲、胞囊線蟲等植物寄生線蟲的防治工作。在淡紫擬青霉菌劑的大規(guī)模高密度的發(fā)酵中，供氧成為提高產(chǎn)品...
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適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的透明顫菌血紅蛋白基因的人工構(gòu)建
本文共20頁 10948字
摘要
淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)是一種重要的植物線蟲寄生真菌，目前已在數(shù)個國家開發(fā)為生物殺線菌劑，廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲、胞囊線蟲等植物寄生線蟲的防治工作。在淡紫擬青霉菌劑的大規(guī)模高密度的發(fā)酵中，供氧成為提高產(chǎn)品效價的主要限制因素之一。透明顫菌血紅蛋白（VHb）能提高細(xì)胞內(nèi)氧傳遞效率，為解決供氧限制問題提供了一條新的思路。本研究經(jīng)人工設(shè)計，構(gòu)建出一種適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的透明顫菌血紅蛋白（VHb）基因——vgbpl基因。擬借助VHb的作用，使淡紫擬青霉的發(fā)酵性能得到改善，在供氧不足時可以獲得更高的生長速率，以提高發(fā)酵的速度和產(chǎn)品效價。
從Genebank中查找透明顫菌血紅蛋白（VHb）的氨基酸序列；根據(jù)密碼子的簡并性以及淡紫擬青霉的密碼子偏好性原則，人工設(shè)計出vgbpl基因的核甘酸序列；根據(jù)重疊PCR的引物設(shè)計原則，將核甘酸序列分成6條寡聚核苷酸片段；經(jīng)重疊PCR，將合成的寡聚核苷酸片段組裝成vgbpl基因。經(jīng)酶切、連接后，將vgbpl基因克隆至真核表達(dá)載體pPIC9K中，而構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPIC9K/vgbpl。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli )DH5α，采用菌落PCR法對重組子進(jìn)行篩選，陽性重組子送上海英俊公司進(jìn)行序列分析。序列分析和比對結(jié)果表明，我們獲得了序列和閱讀框正確的重組質(zhì)粒pPIC9K/vgbpl。
總之，本研究根據(jù)透明顫菌血紅蛋白（VHb）的氨基酸序列，人工設(shè)計出適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的vgbpl基因，通過重疊PCR成功構(gòu)建出vgbpl基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K/vgbpl。這些工作為vgbpl基因轉(zhuǎn)入淡紫擬青霉并實現(xiàn)VHb穩(wěn)定而高效的表達(dá)奠定了重要基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：淡紫擬青霉；透明顫菌血紅蛋白；基因；人工設(shè)計；構(gòu)建
參考文獻(xiàn)
[1] Jatala P. Biological control of plant-parasific nematodes [J]. Ann Rev Phytopathol, 1986, 24:435~439.
[2] 陳淑鴻, 高學(xué)彪. 淡紫擬青霉MCWA18菌株對爪哇根結(jié)線蟲卵孵化率的影響[J].中國生物防治,2000,16(2):78~80.
[3] Stirling G R. Biological Control of Plant Parasitic Nematodes Progress, Problems and Prospects. C. A. B International, 1991: 137～ 142
[4] Khan MR, Goswami BK. Evaluation of Paecilomyces lilacinus isolates against Meloidogyne incognita infecting tomato [J]. International Journal of Nematology, 2002, 12(1):111~114.
本文共20頁 10948字
摘要
淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)是一種重要的植物線蟲寄生真菌，目前已在數(shù)個國家開發(fā)為生物殺線菌劑，廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲、胞囊線蟲等植物寄生線蟲的防治工作。在淡紫擬青霉菌劑的大規(guī)模高密度的發(fā)酵中，供氧成為提高產(chǎn)品效價的主要限制因素之一。透明顫菌血紅蛋白（VHb）能提高細(xì)胞內(nèi)氧傳遞效率，為解決供氧限制問題提供了一條新的思路。本研究經(jīng)人工設(shè)計，構(gòu)建出一種適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的透明顫菌血紅蛋白（VHb）基因——vgbpl基因。擬借助VHb的作用，使淡紫擬青霉的發(fā)酵性能得到改善，在供氧不足時可以獲得更高的生長速率，以提高發(fā)酵的速度和產(chǎn)品效價。
從Genebank中查找透明顫菌血紅蛋白（VHb）的氨基酸序列；根據(jù)密碼子的簡并性以及淡紫擬青霉的密碼子偏好性原則，人工設(shè)計出vgbpl基因的核甘酸序列；根據(jù)重疊PCR的引物設(shè)計原則，將核甘酸序列分成6條寡聚核苷酸片段；經(jīng)重疊PCR，將合成的寡聚核苷酸片段組裝成vgbpl基因。經(jīng)酶切、連接后，將vgbpl基因克隆至真核表達(dá)載體pPIC9K中，而構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPIC9K/vgbpl。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli )DH5α，采用菌落PCR法對重組子進(jìn)行篩選，陽性重組子送上海英俊公司進(jìn)行序列分析。序列分析和比對結(jié)果表明，我們獲得了序列和閱讀框正確的重組質(zhì)粒pPIC9K/vgbpl。
總之，本研究根據(jù)透明顫菌血紅蛋白（VHb）的氨基酸序列，人工設(shè)計出適合于淡紫擬青霉高效表達(dá)的vgbpl基因，通過重疊PCR成功構(gòu)建出vgbpl基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K/vgbpl。這些工作為vgbpl基因轉(zhuǎn)入淡紫擬青霉并實現(xiàn)VHb穩(wěn)定而高效的表達(dá)奠定了重要基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：淡紫擬青霉；透明顫菌血紅蛋白；基因；人工設(shè)計；構(gòu)建
參考文獻(xiàn)
[1] Jatala P. Biological control of plant-parasific nematodes [J]. Ann Rev Phytopathol, 1986, 24:435~439.
[2] 陳淑鴻, 高學(xué)彪. 淡紫擬青霉MCWA18菌株對爪哇根結(jié)線蟲卵孵化率的影響[J].中國生物防治,2000,16(2):78~80.
[3] Stirling G R. Biological Control of Plant Parasitic Nematodes Progress, Problems and Prospects. C. A. B International, 1991: 137～ 142
[4] Khan MR, Goswami BK. Evaluation of Paecilomyces lilacinus isolates against Meloidogyne incognita infecting tomato [J]. International Journal of Nematology, 2002, 12(1):111~114.
