摘要
L-苯丙氨酸是人體必須的八種氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，化工等行業(yè)。
我國Ｌ－苯丙氨酸年需求量在2000噸以上,雖然國內(nèi)也有小規(guī)模生產(chǎn)的報道，但
主要依賴進(jìn)口
[1,2]
。因此研究、開發(fā)高效的Ｌ－苯丙氨酸的生產(chǎn)技術(shù)具有重要的
現(xiàn)實意義。
在眾多苯丙氨酸的工業(yè)化工藝路線中，將化學(xué)合成法和生物酶法催化相結(jié)
合，由海因合成亞芐基海因再水解為苯丙酮酸，再以苯丙酮酸為底物，經(jīng)生物轉(zhuǎn)
氨催化制備L-苯丙氨酸的路線因其工藝路線簡單，方法穩(wěn)定而備受關(guān)注。
[3]
南京
工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院經(jīng)過多年研究，已經(jīng)從根本上解決了原料苯丙酮酸
的生產(chǎn)問題，使得該苯丙氨酸合成工藝路線的突破成為可能
[4]
，而催化苯丙酮酸
（PPA）制備L-苯丙氨酸的高產(chǎn)生產(chǎn)菌的選育則是該工藝路線急需突破的另一瓶頸
[5]
。本研究利用基因工程的方法構(gòu)建高效表達(dá)苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的生物工程菌并對
外源基因表達(dá)的調(diào)控進(jìn)行研究。
為了獲得具有高活力天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因工程菌，本研究設(shè)計AspC引物
在大腸桿菌中獲取了編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因aspC的ORF。將其與本室構(gòu)建
的組成型啟動子P121連接后分別插入至pUC19，pSE380，pet22b三個不同的載
體中，從而構(gòu)建出三種組成型表達(dá)質(zhì)粒：pUC/aspC；pET/aspC；pSE/aspC，并
分別轉(zhuǎn)化至不同的宿主菌中，其中以Escherichia.coli BL21為宿主的工程菌具
有較快的生長速度和較高的酶活。通過對重組質(zhì)?？截悢?shù)，生長曲線及產(chǎn)酶情況
的比較，結(jié)果表明，BL21-pET/aspC因其所含組成型質(zhì)粒拷貝數(shù)略低于其他兩株
菌，外源基因表達(dá)量相對較低，對宿主的壓力較小，發(fā)酵后可獲得較高的生物量，
另外單位細(xì)胞的蛋白表達(dá)量相對較低，有利于蛋白的正確折疊，減少了包涵體的
產(chǎn)生，從而發(fā)酵后重組菌總酶量表達(dá)高于其他兩種重組子。而且本實驗新構(gòu)建的
三種重組菌經(jīng)檢測均具有良好的輔酶PLP的再生體系，使該法制備L-Phe更具實
際應(yīng)用價值。
本文對篩選出的重組菌BL21/pET-aspC做了搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，探討了不同培養(yǎng)工藝條件下重組菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性問題，獲得以玉米漿為主要營養(yǎng)物的廉價而
高效的營養(yǎng)體系，相對出發(fā)培養(yǎng)基LB，酶比活力由80左右提高至180 u/mL多，
目的基因表達(dá)量大幅度提高，同時又大大降低了發(fā)酵成本。以優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵
重組菌，直接以發(fā)酵液為酶液轉(zhuǎn)化底物天冬氨酸和苯丙酮酸制備L-苯丙氨酸。
以天冬氨酸和苯丙酮酸（30g/L）為底物，生成L-苯丙氨酸25.53g/L，轉(zhuǎn)化率高
達(dá)85.1％。該體系無需IPTG誘導(dǎo)，體現(xiàn)了良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
關(guān)鍵詞：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；L－苯丙氨酸；苯丙酮酸




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